Obwohl Agent Phil Coulson (Clark Gregg) im Vorfeld der Schlacht um New York scheinbar von Loki getötet wurde, konnte sein Leben gerettet werden. Nach einer Zeit der Regeneration auf Tahiti kehrt er in den aktiven Dienst bei S.H.I.E.L.D. zurück, wo er ein neues Team zusammenstellt, bestehend aus dem Kampfexperten Grant Ward (Brett Dalton), den Wissenschaftlern Leo Fitz (Ian de Caestecker) und Gemma Simmons (Elizabeth Henstrige) und der Pilotin Melinda Mae (Ming-Na Wen). Außerdem rekrutieren sie die Hackerin Skye (Chloe Bennet), die an sich für eine regierungsfeindliche Gruppierung names Rising Tide arbeitet. Gemeinsam untersuchen sie Vorfälle, die auf das Vorhandensein von Superhelden und übernatürlichen Artefakten auf der Erde hindeuten. Doch S.H.I.E.L.D. ist nicht allein: Auch eine Verbrecherorganisation mit dem Namen Centipede interessiert sich für die Erkenntnissen und Superkräfte, welche S.H.I.E.L.D. untersucht...